DNA测序

（一）ABI3730XL测序仪技术原理：

ABI3730测序仪测序的基本原理：ABI3730XL自动测序仪是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。3730XL测序仪拥有96道毛细管，使用荧光标记的Sanger测序法，4种双脱氧核苷酸（ddNTP）的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管时，不同长度的DNA片段上的4种荧 光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列，从而 大大提高了DNA测序的速度和准确性。

我公司DNA测序流程如下：

（二）测序送样品要求：

1. 菌样

1）请注明载体类型和抗性，我们常备Amp，Kan两种抗生素，其他抗性请自备。  若菌中包含的质粒为低拷贝，请直接提供约3μg的纯化质粒。

若使用了特殊的抗生素，请提供2ml菌液和抗生素或质粒。

4）若菌液需培养，请提供至少500μl过夜培养的菌液，封口保存以防止交叉污染或渗漏。

5）若菌液无需培养，直接抽提质粒，请提供至少4ml已培养好的菌液。

6）若有大量样品进行测序，建议在Eppendorf管中穿刺培养菌种。

7）若样品为噬菌体，请提供质粒，我们不收取菌液。

2.质粒

1）若提供质粒，请确保使用的溶剂为灭菌的双蒸水，浓度＞100ng/μl，总体积＞10μl。

2）若有可能，请提供1ml左右含有相应质粒的菌液备用。

3）请注明载体名称及插入片段的长度。

4）若质粒较大，请注明载体长度。

3. 已纯化PCR产物

1）若提供已纯化PCR产物，请确保使用的溶剂为灭菌的双蒸水，浓度＞50ng/μl，总体积＞20μl。

2）请确保纯化的PCR产物电泳结果为单一的条带，否则将影响测序结果或导致测序失败。

3）请注明测序片段长度，片段长并需测通或双向测序的样品需适当增加送样体积。

4. 未纯化PCR产物

1）若提供未纯化的PCR产物，请确保片段长度大于100bp，小于2Kb，浓度＞50ng/μl，总体积＞50μl。

2）片段长度若大于2Kb，建议您克隆后再测序。

3）请注明片段长度，便于核对样品测序是否成功及安排样品测通、拼接工作。

4）建议提供电泳结果为单一明亮的特异性条带的PCR产物。

5）若要自行提供引物，请确保引物经过PAGE纯化，浓度＞5pmol/μl（或5μmol/μl），总体积＞10μl；若提供干粉，请注明OD值。另外，请提供引物全序列、PCR退火温度等信息。随机引物、标记引物和简并引物不能用于测序。

6）发送测序结果一个月后，若客户无要求返还样品或引物等，我们则将代为销毁。

（三）送样及订单填写细则：

1.样品信息

1）请确保样品管上的编号和登记表上的样品编号一致，以免造成样品混淆。样品编号请勿使用汉字或特殊字符（仪器只识别“+“–“.”）须半角状态下输入。

2） 需单向测通或测通的样品，请在表上注明，便于我们直接安排测通工作，同时节省您的测序时间。

3）若测序样品为菌液和质粒，请正确填写载体及引物名称，从而避免因信息错误造成测序不成功。

4）若使用我们的通用引物进行测序，请详细、准确、完整的填写载体名称，以免用错引物。如：只填写T载体，则无法判断为pGEM-T还是pMD18-T，而这两种T载体的引物是不能共用的；pMD18-T、pUC18（118）、pUC19（119）等系列载体测序引物请勿填写为正向（+， M13+，M13F）或反向（－， M13-，M13R）等容易造成误解的信息，而是要注明为M13F（-47）或M13R（-48）。

5）若测序引物不是通用引物，请提供相应的引物进行测序。另外，我们也提供引物设计、合成的服务，若您希望我们帮忙设计测序引物，请提供电子版的载体图谱和序列（标明酶切位点和测序方向）信息。

6）若为菌液测序，请注明抗生素和培养基类型。我们常备Amp，Kan两种抗生素及LB培养基，若为其他抗生素或培养基，请直接提供5ml新鲜菌液或质粒进行测序。

7）若测序样品中存在特殊结构，如GC rich、poly结构、发夹结构、重复序列、复杂结构等，请特别注明。便于我们有针对性的调整实验条件，以提高测序的成功率。

（四）公司提供的测序报告格式：

1、测序报告通常采用电子邮件的形式发送，分别为一份abi格式的峰型彩图和一份seq格式的序列文件；

2、如果您有特殊需要，我们可以免费提供一份打印的纸质彩图或是数据光盘。